分子生物学实验复习资料

1、什么是质粒？质粒的基本性质有哪些？

①质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸（DNA）分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用作基因的载体。

②具有复制起点；携带易于筛选的选择标记；具有多种限制性内切酶的切割位点；具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。

2、质粒抽提实验中溶液I、II、III各有什么作用？

①溶液I：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成（保护、缓冲）。

葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒（保护作用）。

EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）。

Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）。

②溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成（裂解、变性）。

SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）。

NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）。

③溶液III：HAc和KAc组成的高盐溶液（复性，分离）。

HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。

KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。

3、在质粒提起实验中，用溶液III处理后，要进行离心分离。此时，质粒DNA分子在（上清液，沉淀物）中，细菌基因组DNA分子在（上清液，沉淀物）中。

上清液；沉淀物。

4、碱裂解法抽提质粒DNA的基本原理是什么？

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。PH介于12.0~12.5时，线性DNA变性，双链打开，而质粒DNA虽变性，但两条互补链彼此缠绕，当PH恢复到中性时，质粒DNA可迅速准确的完成复性，而线性DNA复性较困难，缠绕成网状，通过离心可沉淀除去。

5、在碱裂解法提取质粒DNA操作中应注意哪些问题？

（1）正确使用移液器。

（2）溶液ll必须新鲜配制。

（3）加入酚-氯仿后必须充分混匀。

（4）混匀的过程不能太过剧烈。

（5）每次弃上清液时都应用移液器吸去管壁上黏附的水珠。

（6）吸取酚-氯仿溶液时要将Tip头插入液体分层的下侧。

6、在碱裂解法提取质粒DNA时，酚/氯仿的作用是什么？

酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶

性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质。

7、在质粒提起实验的最后两步，要加入2倍体积的乙醇和70%的乙醇溶液。这里不同浓度乙醇的作用是什么？

无水乙醇的为了是沉淀DNA继而达到浓缩DNA的目的，70％的乙醇是为了洗涤DNA，进一步除去杂质。

8、提取植物基因组DNA的基本原理是什么？在操作过程中应该注意什么？

①基本原理：利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经异丙醇沉淀。

②注意事项：

⑴材料要新鲜娇嫩，叶片研磨地越细越好；

⑵操作应为无菌操作；

⑶操作应温和，不宜剧烈晃动；

⑷注意移液器的正确使用。

9、在植物基因组提取过程中，DNA降解的可能原因？

⑴从植物中提取DNA时没对细胞内的DNA酶进行灭活；

⑵操作过程中被细菌污染了；

⑶口水等含酶物质飞入样品中；

⑷温度、PH等变化过于剧烈。

10、在植物基因组提取过程中，提高DNA产量的措施？

应当选取幼嫩的叶片，因为幼嫩叶片中的DNA含量高些；组织抽提前要保存在液氮中，以免DNA被破坏；纯化时注意抑制核酸酶污染，使用EDTA等防止DNA降解；整个实验过程应该温和操作，不能剧烈振荡，混合过程要轻缓，减少抽提，减少DNA片段被认为降解，因为过度振荡会使DNA断裂成小片段。

11、在使用苯酚进行DNA提取时应该注意什么？

酚一定要进行碱平衡，苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜、眼睛会对人体造成损伤，应当注意防护；它是出去蛋白质的，要充分振荡使蛋白质变性，但不能太剧烈而打断DNA；离心后应该避免再次吸入有机相的苯酚—氯仿，尽量只取上清，不应该让苯酚最后仍有残留，需抽提干净。

12、在提取植物基因组DNA过程中，使用苯酚与氯仿的作用是什么？

用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保证提取的基因组较纯净。

13、在植物基因组提取过程中，该如何检测和保证基因组DNA的质量？

检测：琼脂糖凝胶电泳；保证DNA活性：用EDTA抑制DNA酶活性，从而保证DNA不被破坏。

14、碱裂解法提取的质粒DNA分子一般有几种构象？电泳时移动速率有何差异？

共价闭环DNA线状DNA开环DNA

15、用琼脂糖凝胶分离DNA的理论依据是什么？

DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速率向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。

16、为何在对凝胶进行操作时要带一次性手套？

琼脂糖凝胶电泳时戴一次性手套能够有效阻止EB的渗入。EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套。

17、DNA分子在电泳缓冲液中带正电荷还是负电荷？它在电场中的移动方向如何？电泳中你观察到哪些现象？

DNA带负电荷，在电场中向正极移动

18、影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素有哪些？分别有何种影响？

①电压越大速率越大。②DNA分子量越小速率越大。③DNA的分子结构：超螺旋最快，线型次之，开环最慢。④介质的种类和浓度。⑤EB⑥电泳缓冲液

19、若有60kb～kb大小的系列DNA片段要进行分离鉴定，应采取哪种类型的电泳方法才能进行有效分离？为什么？

恒定电场强度下的琼脂糖凝电泳。糖凝胶可以制成不同大小的孔隙度，具有分子筛的效应，所以恒定场的琼脂糖凝胶电泳适于分离60kb-kb的DNA片段，DNA片段的迁移率和分子的大小和高级结构有密切关系。

20、简述PCR反应的原理。

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断。

PCR基本原理类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定。引物就是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸。双链DNA是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子（变性），两引物分别与两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，在引物的引导下，按5→3方向复制互补DNA，即引物的延伸。在适宜的条件下，这种热变性→复性→延伸的过程不断循环重复，前一个循环的产物DNA可作为后一个循环的模板DNA参与DNA合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。

21、PCR一般体系应加入哪些试剂？

模板

引物

TaqDNA聚合酶

4种dNTP混合物

Mg2+

10×缓冲液

22、PCR防止其它DNA污染，应注意哪些问题？

标本放置时密封要严避免溢于容器外，容器要清洁避免造成相互间交叉污染；移液器使用要规范避免污标本间污染；无菌工作台操作，避免气体中有杂菌。

23、影响PCR产物产量的因素主要有哪些？

引物、酶的种类及浓度、dNTP的质量（优劣）与浓度、模板核酸的量与纯化程度、Mg2+浓度、温度与时间、循环次数。

24、引物设计应注意哪些问题？

（1）引物长度不宜过长20bp左右较佳；

（2）引物扩增片段的长度以-为宜；

（3）引物碱基的中G+C的含量应在40-60%为宜，G+C太少则扩增效果不佳，G+C过多则易出现非特异条带；

（4）避免引物内部出现二级结构，避免两天引物间互补，特别是3端的互补否则会形成二聚体结构；

（5）引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

25、简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤？

克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技术对基因进行大量扩增，首先准备好实验材料大体为：需扩增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR缓冲液、引物等、其过程大体分为3个步骤：

第一步：变性：通过加热使DNA模板双螺旋链解离为单链，

第二步：退火：当温度突然降低时。由于模板DNA结构复杂难再互补，而引物建构简单且数量巨多易于模板DNA互补杂交从而使引物结合到模板上DNA上，

第三步：延伸：在DNA聚合酶和四种底物及镁离子存在条件下DNA连开始延伸。以上3个步骤为一个循环，数小时后即可得到大量扩增的目的片段。

26、什么是限制性内切酶？

限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，有三种类型，Ⅰ类，Ⅱ类，Ⅲ类，他们都有甲基化修饰功能和限制酶功能，Ⅱ类常用于分子克隆

27、常见的Ⅱ型限制性内切酶切割双链DNA后会产生末端或末端。

粘性，平

28、下列有关限制性内切酶的描述，错误的是：（C）

A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

B．限制性内切酶的活性受温度的影响

C．限制性内切酶能识别和切割RNA

D．限制性内切酶可以从原核中提取

29、现有一长度为0bp的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRI酶切后得到的DNA分子仍是0bp，用KpnI单独酶切得到bp和bp2种长度的DNA分子．用EcoRI，Kpnl同时酶切后得到bp和bp2种长度的DNA分子。请画出该DNA可能的酶切图谱。

30、一个限制性内切酶的识别序列和切割位点是5ˊ一G↓GATCC一3ˊ，在质粒上有该酶的一个切点，请画出质粒被该限制性内切酶切割后所形成的黏性末端。

--GGATCC--写在上面，

--CCTAGG--写在下面。

该酶为限制性内切酶I。

31、基因工程中，切割目的基因和载体所用的限制酶及切口必备的特点是（A）

A．可用不同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同

B．必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端可不相同

C．必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同

D．可用不同的限制性内切酶，露出不同的黏性末端

32、在遗传工程技术中，限制性内切酶主要用于（D）

A.目的基因的提取和导入

B.目的基因的导入和检测

C.目的基因与运载体结合和导入

D.目的基因的提取和与运载体结合

33、在分子生物学实验中，常使用微量移液器，请说明在使用微量移液器时需要注意什么？

1.确定合适的量程，不可超过量程取液。

2.取液时按到第一档，Tip头垂直进入液面3-5毫米取液。移液器注意不能接触溶液。

3.打出液体时贴壁并有一定角度，要按到第二档将液体全部压出。

4.使用完毕后，打下tip头，放好移液器。

34、现有量程为0.1-2.5ul；1-10ul；2.5-20ul；10-ul；-0ul的移液器各一支，请问，当吸取0.15ul，0.5ul，5ul，15ul，ul，ul液体时，各需要选取哪种最佳量程范围的移液器？

分别是0.1-2.5，0.1-2.5，1-10，2.5-20，10-，-0。

35、本学期我们学习了CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞和热休克法转化质粒DNA，你还知道哪些方法可以制备大肠杆菌感受态细胞和转化的方法？

甘油—聚乙二醇法，一步法，山梨醇、CaCl2、RbCl等化学试剂法。

36、在质粒DNA转化大肠杆菌时，是如何进行筛选的？

因为质粒pETBlue-2带有青霉素抗性基因，所以转化成功的大肠杆菌细胞能在含羧苄青霉素的琼脂糖平板上生长形成菌落。所以用含羧苄青霉素的琼脂糖平板可以筛选出转化成功的大肠杆菌。

37、蓝白班筛选的原理是什么？

一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

38、在质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞时，如果将用来浸泡玻璃棒的酒精引燃起火该如何处理？

用水打湿的毛巾，着火时用毛巾盖上就行了

39、卫星菌落出现的原因是什么？该如何避免？

（1）卫星菌落是氨苄降解后生长的杂菌。可能是感受态细胞的问题也可能是转化过程出现操作失误例如未在冰中进行转化，感受态在常温下放置过久失活，转化后摇菌时间过短，或者摇床速度过慢，没有把菌摇起来，如果不是转化过程出现的问题就要进一步考虑连接是否正确，连接时间12~16h，体系一般6ul-10ul，目的片段：载体一般1:3~1:10.

（2）可以将培养时间控制在12h-16h之间，或者更换抗生素为羧苄青霉素

40、影响所制备感受态效率的因素有哪些？

（1）大肠杆菌生长状态

（2）氯化钙浓度

（3）冰上放置时间

（4）保存温度

41、转化后为什么要温育1小时，为什么加入的是无抗培养基？

（1）温育就是让感受态恢复一下状态，以及一些相关抗性基因的表达。毕竟从-70℃环境中取出，需一段时间适应才可转化。

（2）因为细胞比较脆弱，加无抗培养基是为了让细胞生长，促使在转化过程中获得的新表型得到表达。

42、如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？

（1）操作过程仪器、器皿等不是无菌的，出现了一些杂菌和杂DNA的污染

（2）细菌在感受态时发生了一些自然变异，对所加的抗生素有一定的抗性，所以长出一些菌落

（3）所加的抑菌抗生素浓度不够，不能够抑制住细菌的生长

（4）一些实验误差，错将菌液放错

43、在转化实验中，实验组和对照平皿应有什么样的结果？如何解释这个结果？

实验组中长出菌落而对照组中无任何菌落生长

44、在学习制备感受态细胞时，为什么要保证细胞密度/ml？甘油的作用是什么？

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，密度过高或不足均会影响转化效率，一次要保证细胞密度/ml。

甘油的目的是防止水在冻结过程中产生过大的冰晶损伤细胞，抑制大肠杆菌生长，以便保存。

45、通过分子生物学实验，你认为自己掌握了哪些实验技能？你对分子生物学实验有哪些建议与意见？